活性氧 檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品貨號(hào)：O040

保存溫度：-20℃，避光保存一年

產(chǎn)品組分：

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

活性氧檢測(cè)試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種利用熒光探針H2DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。H2DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。根據(jù)活細(xì)胞中熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞活性氧的含量和變化。用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可直接觀察，是一種經(jīng)典的組織或活細(xì)胞中活性氧檢測(cè)方法。本試劑盒提供了活性氧陽(yáng)性對(duì)照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測(cè)。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/mL。Rosup 為活性氧陽(yáng)性誘導(dǎo)藥物，根據(jù)其熒光信號(hào)強(qiáng)度，可分析活性氧的真正水平。

本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。本試劑盒可以測(cè)定1000個(gè)樣品1000T(96 孔板)。

注意事項(xiàng)：

1. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。

2. 陽(yáng)性對(duì)照Rosup 一般使用濃度為100 μM （推薦濃度100-400μM，具體依細(xì)胞類(lèi)型而定）。通常刺激后0.5-4h 可觀察到顯著的活性氧水平升高。對(duì)于不同的細(xì)胞，活性氧陽(yáng)性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30min 內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)提高活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。如果活性氧升高得過(guò)快，可縮短誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)降低活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。

3. 對(duì)于某些特別的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)沒(méi)有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)， 可以按照1:2000-1:5000 稀釋DCFH-DA， 使DCFH-DA 的終濃度為2-5 μM。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60 min 內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

4. 活性氧陽(yáng)性對(duì)照(Rosup) 僅僅用于作為陽(yáng)性對(duì)照的樣品，并不是在每個(gè)樣品中都需加入活性氧陽(yáng)性對(duì)照。

5. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請(qǐng)參考上圖。

6. 盡量縮短探針裝載后到測(cè)定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

7. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

8. 定量的話要作標(biāo)準(zhǔn)曲線吧。先做一個(gè)不同濃度H2O2氧化DCFA熒光值，做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，X軸為H2O2濃度，y軸是熒光值，得出一個(gè)方程，在看你樣品的熒光值即Y值是多少，對(duì)應(yīng)的X值就是。

9. 有的細(xì)胞裝載探針后細(xì)胞容易漂起來(lái)，洗細(xì)胞時(shí)實(shí)驗(yàn)組會(huì)吸走一部分細(xì)胞。所以種細(xì)胞時(shí)細(xì)胞量增加一倍，這樣細(xì)胞緊密連接，貼壁比較牢，實(shí)驗(yàn)組的熒光值就高了。另外的H2DCFDA很敏感，工作液濃度要低一些，1-2μM就夠啦，濃度太高容易有非特異性染色。這個(gè)探針很不穩(wěn)定，一旦氧化了本底熒光值就會(huì)升高，最好工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

使用說(shuō)明：

1. 裝載ROS 探針

1.1 原位裝載探針(僅適用于貼壁細(xì)胞)

a) 細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測(cè)前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測(cè)時(shí)細(xì)胞數(shù)量小于5×105/ml。

b) 藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥物特性和細(xì)胞類(lèi)型決定。

c) （可選）陽(yáng)性對(duì)照：先用無(wú)血清培養(yǎng)基等稀釋陽(yáng)性對(duì)照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細(xì)胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提高活性氧水平，不同細(xì)胞類(lèi)型存在差異。例如：HeLa 細(xì)胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纖維細(xì)胞則需孵育90 min。

d) ROS 探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) ROS 探針裝載：吸除處理藥物，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA 工作液。加入的體積需充分蓋住細(xì)胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，對(duì)于96 孔板通常不少于100 μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。

f) 細(xì)胞清洗：用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1～2 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2 收集細(xì)胞后裝載探針(適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)

a) 細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測(cè)用細(xì)胞狀態(tài)。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。

b) 藥物誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥物特性和細(xì)胞類(lèi)型決定。

c) （可選）陽(yáng)性對(duì)照：先用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋陽(yáng)性對(duì)照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細(xì)胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提高活性氧水平，不同細(xì)胞類(lèi)型存在差異。例如：HeLa 細(xì)胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纖維細(xì)胞則需孵育90min。

d) ROS 探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) 探針裝載：除去細(xì)胞內(nèi)藥物，離心收集細(xì)胞，加入稀釋好的探針，使其細(xì)胞密度為1×106 ～ 2×107。

注意：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測(cè)體系，檢測(cè)方法，以及檢測(cè)總量來(lái)進(jìn)行調(diào)整。例如：對(duì)于流式分析，單管檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。

f) 細(xì)胞清洗：用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

2. 熒光顯微照相操作方法

a) 對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取25-50 μL 細(xì)胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。

b) 熒光顯微鏡下，選用FITC 濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。

3. 流式細(xì)胞分析操作方法

a) 對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，用yi酶消化制備成單細(xì)胞懸液；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，直接收集細(xì)胞。用0.5-1 mL PBS 重懸細(xì)胞(0.5～1 x 105/ml)。

b) 選擇流式細(xì)胞儀FL1 或BL1 通道，488nm 激發(fā)，測(cè)定530nm 的發(fā)射，細(xì)胞應(yīng)可分成兩個(gè)亞群：ROS 陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS 陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光。

4.參數(shù)設(shè)置

使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

使用活性氧檢測(cè)試劑盒(Reactive oxygen species assay kit)顯示CHO細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光。

左圖：CHO細(xì)胞用試劑盒配備的活性氧陽(yáng)性對(duì)照處理；右圖：正常CHO細(xì)胞。綠色熒光表明細(xì)胞活性氧急劇增加，并能顯示其定位。